Page 56 - 《含能之美》2019封面论文

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球 形 红 细 菌 降 解 对 硝 基 酚 特 性 及 响 应 面 优 化
研 究 氧 含 量 和 光 照 条 件 对 H 菌 株 生 长 和 降 解
2
材料与实验
PNP 效率的影响，设置 4 种培养条件：厌氧光照、厌氧
2.1 黑暗、好氧光照和好氧黑暗，光照度为 2500 lux，好氧
试剂及仪器
-1
条 件 采 用 摇 床（振 荡 速 度 为 130 r·min ）、黑 暗 条 件
对硝基苯酚（p‑nitrophenol，PNP，纯度 98%），淡
（用 7 层黑布包裹），每隔 24 h 取样检测。
2.3.3 H 菌株降解 PNP 的单因素实验
黄色结晶，常温下微溶于水，不易随蒸汽挥发，易溶于
乙醇和乙醚，购自天津市凯通化学试剂公司；苹果酸、
控制实验中的单因素：在 20，25，30，35，40 ℃下，
4
2
4
酵母膏、（NH ）SO 均为分析纯，购自天津市科密欧化 -1
pH 值 为 7.0 含 有 80 mg·L 的 PNP 培 养 基 中 ，按 照
学试剂开发中心；实验用水为二次去离子水。
15% 的接菌量接种菌悬液，进行降解实验研究。然后
主要仪器有 UV2100 型分光光度计（上海尤尼柯
分别设置 pH 值 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，PNP 初始浓度
公司），高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗
-1
60，80，100，120 mg·L ，接 种 量 5%、10%、15%、
设备厂），分析天平（梅特勒‑托利多仪器上海有限公
20%、25%，进 行 单 因 素 实 验 。 每 隔 24 h 取 5 mL 菌
司），超净操作台（苏州安泰空气技术有限公司），人工
-1
液，在 9500 r·min 下离心 10 min，在波长 400 nm 处
气候箱（上海——恒科学仪器有限公司），HC‑3018 高
［19］
测定样品上清液中 PNP 的含量 。
速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。
2.2 考察不同氮源对 H 菌株降解 PNP 的影响，分别以
菌种及培养基
-1
4 2
4
菌 株 ：球 形 红 细 菌（Rhodobacter sphaeroides）H 0.45 g·L 的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、（NH ）SO 、
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3
3
NH NO 、KNO 作为培养基中的氮源，选出影响最大
菌株系紫色非硫菌群红细菌属光合细菌，由山西大学
的有机氮源和无机氮源，作为培养基中的组合氮源，分
［18］
光合细菌研究室分离、鉴定并保存 。
基础培养基：苹果酸 2.5 g、酵母膏 1.0 g、（NH ）SO 4 析对 H 菌株降解 PNP 的影响。培养 168 h 后取样，测
4 2
定上清液中残留的 PNP 浓度，将菌体沉淀物重新悬于
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2
2
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1.25 g、MgSO 0.2 g、CaCl 0.07 g、K HPO 0.9 g、
5 mL 蒸馏水中，在波长 590 nm 处测 OD 值，表示其生
2
4
KH PO 0.6 g、蒸馏水 1000 mL。
物量。
2.3.4
驯化培养基：在基础培养基中分别加入 PNP，使之
-1 -1 响应面优化 H 菌株降解 PNP 的实验
终浓度分别为 40，60，80，100 mg·L 和 120 mg·L 。
2.3 实验方法 依据以上单因素实验，选取对 H 菌株降解 PNP 的
2.3.1 驯化菌种及菌悬液制备 显著影响因素，设计不同水平的取值，进行响应面优化
分 析 实 验 。 利 用 软 件 Design Expert 10.0 中 的
在驯化培养基中，接入 15% 的 H 菌株，在 30 ℃下
Box‑Behnken 模型来设计响应面的优化实验方案，温
将光照强度设定为 2500 lux，培养基中 PNP 终浓度由
-1
-1
40，60，80，100 mg·L 增加到 120 mg·L ，培养驯化 5 度（A）、pH 值（B）、PNP 初始浓度（C）做自变量，响应面
实验因素及水平设计见表 1。
个 周 期 。 在 离 心 管 中 取 10 mL 驯 化 后 的 菌 液 ，在
-1
9500 r·min 下离心 10 min，弃去上清液后，用磷酸缓 表 1 响应面优化 H 菌株降解 PNP 的实验因素及水平
Table 1 Response surface methodology for optimizing the
冲 溶 液 冲 洗 两 次 ，将 菌 体 重 新 悬 于 基 础 培 养 基 中 ，
degradation of PNP by strain H
备用。
2.3.2 不同体系中 PNP 的降解实验 levels factor
A B C
为了证明 H 菌株是降解 PNP 的主体，设置不同的 25 7.0 75
实验体系进行 4 组平行实验：（1）含有 80 mg·L -1 PNP low（-1）
middle（0） 30 8.0 80
的培养基和 H 菌株；（2）只含有 80 mg·L -1 35 9.0 85
PNP 的培养
high（1）
基；（3）含有 80 mg·L -1 PNP 的培养基和灭活 H 菌株；
（4）蒸馏水中含有 80 mg·L -1 PNP 和 H 菌株。通过接 根据模型优化后的降解条件进行验证实验，测定
种一定量的 H 菌株，使培养基中的 H 菌株生物量达到 PNP 的浓度，验证响应面模型预测数据的可靠性。
OD 590 为 0.182。用橡胶塞将血清瓶密封置于 30 ℃的 2.3.5 H 菌株生长与 PNP 降解动力学实验
人工气候箱中，光照强度为 2500 lux，每隔 24 h 取样 在 最 优 条 件 下 进 行 H 菌 株 降 解 PNP 实 验 ，每 隔
检测，每个样品重复测定三次，取其平均值。 24 h 取 5 mL 菌液，测定 PNP 浓度和菌体生物量，并考
CHINESE JOURNAL OF ENERGETIC MATERIALS 含能材料 2019 年 第 27 卷 第 7 期 （542-549）