1 引 言
奥克托今(HMX)是当前使用的能量水平最高、综合性能最好的炸药之一，并由于其良好的爆炸性能被广泛应用于武器系统的战斗部装药。但是HMX是一种有毒的含能化合物，生产使用HMX过程中的不恰当操作使工厂周围的环境受到严重污染，同时对哺乳动物的中枢神经系统有不良影
响[1] 。美国环境保护署已经将其列为优先控制污染物名单[2] 。近年来，国外很多学者已经对微生物降解HMX的产物及途径进行了研究。Hawari
等[3] 研究了厌氧污泥转化HMX，然后通过开环裂解产生次甲基二硝胺（MEDINA）和双(羟甲基)‑硝胺，最终降解为一氧化二氮(N2 O)、甲醛(HCHO)和CO2 ，导致环裂解的最初反应机理尚不清楚。Bhushan等[4] 报道利用黄嘌呤氧化酶(XO)在厌氧条件下HMX脱氮，然后环裂解成MEDINA、4‑硝基‑2,4‑重氮丁醛(NDAB)、HCHO和甲酸(HCOOH)。Fournier等[5] 利用黄孢原毛平革菌好氧生物降解HMX，首先，HMX被还原为1‑NO‑HMX，然后沿着不同的两条途径降解；第一条是1‑NO‑HMX经N‑脱硝基后生成带有活性的亚胺键（─C N─）的中间产物，再与1分子水生成中间产物α‑羟基‑烷基硝胺；第二条是1‑NO‑HMX经α‑羟基化作用生成二乙基亚硝胺；降解产生的中间产物不稳定，开环裂解成4‑硝基‑ 2,4‑重氮丁醛（4‑NDAB）、一氧化二氮(N2 O)和甲醛(HCHO)。Van Aken[6] 利用甲氧杆菌降解HMX，该菌株以甲醇为唯一碳源和能源，从HMX转化过程中检测到的代谢产物包括一种单硝基HMX衍生物和一种初步鉴定为亚甲基硝胺的极性化合物。综上所述，不同的微生物降解HMX时所生成的中间产物及最终产物不同，因此，其降解途径也不同。国内学者对微生物降解HMX还处于对其降解特性的研究阶段，少见降解途径及产酶特性研究。球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是兼性细菌，也是益生菌。它既能在厌氧条件下利用光照进行生长，也能在好氧条件下利用有机物生
长[7] 。前期研究表明[8] ，球形红细菌能在96 h降解HMX达到88.9%，但是对降解途径及产酶特性还需要进行深入研究。为此，本研究采用球形红细菌对HMX进行降解，并利用液相色谱‑质谱联用仪(LC‑MS)方法对球形红细菌降解HMX的中间产物进行初步鉴定，推测其可能的降解途径；同时研究了不同营养因素对球形红细菌降解HMX的影响，以及对菌株产生的粗酶液分析，为该菌株在杂氮化合物废水污染治理中的应用提供理论依据。2 材料与方法
2.1 材 料
菌种：球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)H菌株系紫色非硫菌群红细菌属光合细菌，由山西大学光合细菌研究室分离、鉴定并保
存[9] 。基础培养基：酵母膏1.0 g,MgS
O4 0.2 g,CaCl2 0.07 g,(NH4 )2 SO4 1.25 g,苹果酸2.5 g,KH2 PO4 0.6 g,K2 HPO4 0.9 g,蒸馏水1000 mL,pH=7.0。液体驯化培养基：基础培养基加适量HMX。
试剂：奥克托今（HMX，纯度99%），阿拉丁公司；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为二次去离子水。
2.2 方 法
2.2.1 H菌株的培养
将10%原始菌液接入HMX含量为100 mg·
L-1 的驯化培养基，在30 ℃、2500 lx光照培养箱中厌氧驯化培养10 d作为驯化菌种。2.2.2 不同营养因素对H菌株降解HMX的影响实验
不同营养因素分别为碳源、氮源和金属离子，碳源分别以2.5 g·
L-1 的乙酸钠、麦芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、柠檬酸和葡萄糖代替苹果酸。氮源分别以0.45 g·L-1 的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素(NH4 )2 SO4 、NH4 NO3 、KNO3 代替驯化培养基中的氮源(NH4 )2 SO4 +酵母膏，进一步以（NH4 NO3 +酵母膏）代替驯化培养基中的氮源(NH4 )2 SO4 +酵母膏，考察组合氮源对该菌株转化HMX的影响。金属离子分别以0.07 g·L-1 的FeSO4 、CoCl3 、ZnSO4 和KCl代替驯化培养基中的金属离子CaCl2 。以上三组按照文献[8]实验方法，在最适条件下接种H菌株，培养96 h后取10 mL样品，离心菌体10 min（转速10000 r∙min-1 ），用紫外可见分光光度计在540 nm测定上清液中残留的HMX浓度[10] ，用等量蒸馏水制备的菌悬液，于波长590 nm处测定OD值，以表示其生物量。各设3个平行样，取平均值。2.2.3 HMX降解产物分离
将培养至对数期的H菌株接种到含100 mg·
L-1 的HMX培养基中，在30 ℃、2500 Lx光照培养箱中厌氧培养，分别在培养48 h和96 h后取样，样品在10000 r∙min-1 离心10 min，取上层清液50 mL于200 mL的干燥烧杯中，用50 mL的乙腈在250 mL干燥的分液漏斗中进行多次萃取。取萃取液于干燥的烧杯中，加入预先干燥过的无水硫酸钠，然后过滤，最后浓缩到5 mL[11] ，用LC‑MS进行分析。2.2.4 H菌株产生的粗酶液性质分析
（1） 粗酶液的制备及蛋白质含量测定
（2） 酶比活力测定
酶比活力的测定参考文献[12]，略作修改。反应体系中含有110 μmol·
L-1 HMX、1.5 mmol·L-1 NADH、50 mmol·L-1 Tris‑HCl缓冲液（pH值为7.0）和200 μL粗酶液，终体积为2 mL。反应从加入还原型辅酶Ⅰ（NADH）后开始，在30 ℃下反应60 min，之后在90 ℃下加热10 min终止反应。将样品在8000 r∙min-1 的离心力下离心3 min，之后在540 nm处通过紫外可见分光光度计测定HMX的吸光度[14] 。酶活力（U）定义为反应条件下每分钟催化生成1 mmol产物（或转化1 mmol底物）所需的酶量；酶比活力定义为每毫克可溶性蛋白质所含酶活力单位数（U/mg
）[12] 。配制不同HMX质量浓度为75,100,125,150 mg·
L-1 的液体驯化培养基，在30 ℃、pH值为7.0和接种量为15%的条件下培养，取样，在8000 r∙min-1 下离心10 min，收集菌体细胞，制备粗酶液，分别测定酶活力，计算酶比活力。将含100 mg·
L-1 HMX的液体驯化培养基，pH值分别调为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，在30 ℃和接种量为15%的条件下培养，取样，在8000 r∙min-1 下离心10 min，收集菌体细胞，制备粗酶液，分别测定酶活力，计算酶比活力。（3） 酶蛋白的SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳
参照文献[13]的方法，稍加修改，对制备的粗酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，电泳在垂直电泳装置中进行，分离胶质量浓度为12%，浓缩胶质量浓度4%，每点样孔加样量30 µL（取15 µL的样品，加入等体积的SDS上样缓冲液，煮沸2 min）。先恒压100 V，样品通过浓缩胶后恒压120 V。电泳结束后进行考马斯亮蓝G‑250染色，染色1 h后，进行脱色，直到背景变清晰后进行拍照。
2.3 分析方法
（1） HMX的浓度测定
参照文献[14]的方法，用可见光分光光度法测定HMX的浓度。
（2） HMX降解产物结构初步鉴定
液相色谱/质谱（LC‑MS）使用MI cromass平台台式单四极质量检测器，由休利特帕卡德1100系列高效液相色谱（HPLC）系统连接，SUPELCOSIL lc‑cn柱（25 cm×4.6 mm×5 μm）。以1 μL·mi
n-1 的流速使用甲醇/水梯度(10%~70%甲醇20 min，70%甲醇3 min，70%~10%甲醇2 min，10%甲醇10 min)。分析物电离主要是[M‑H]的负喷雾ES(‑)电离模式中进行[11] 。3 结果与分析
3.1 不同营养因素对H菌株降解HMX的影响
3.1.1 不同碳源对H菌株生长及降解HMX的影响
不同碳源对H菌株生长及降解HMX的影响的结果如图1所示。由图1可以看出，以苹果酸作碳源，菌体生物量OD值最高，为2.388；无碳源时菌体生物量OD值最低，仅为0.612。培养液中添加不同碳源时，影响菌体生物量OD值由大到小的碳源排列顺序为：苹果酸、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、柠檬酸、乙酸钠。这表明H菌株容易利用的碳源是苹果酸，其次是葡萄糖、麦芽糖和乳糖；柠檬酸虽然也能作为生长基质被细菌利用，但是作用效果相对较差；而当HMX作为唯一碳源时，与无碳源的空白相比，菌体浓度有所增加，这说明HMX能被H菌株作为唯一碳源利用，但是利用率不高。
图1 不同碳源对H菌株生长及降解HMX的影响
Fig.1 Effect of different carbon source on the growth of strain H and degradation of HMX
注：1—葡萄糖, 2—麦芽糖, 3—乳糖, 4—蔗糖, 5—可溶性淀粉，6—乙酸钠, 7—柠檬酸, 8—苹果酸, 9—HMX作为唯一碳源,10—无碳源
NOTE: 1—amylaceum, 2—malt dust,3—milk sugar,4—saccharose, 5—amylogen,6—sodium acetate,7—citric acid,8—malic acid,9—HMX as the sole carbon source,10—no carbon source
当苹果酸作为碳源时，菌体对HMX的降解率最高，为88.9%，其次是葡萄糖、麦芽糖和乳糖，菌体对HMX的降解率分别为86.5%、34%和33.2%。乙酸钠和HMX作为碳源时，HMX的降解率都比较低，分别为28.1%和22.6%。由此可知，不同碳源种类对H菌株的生长和HMX的去除影响较大，使用容易被H菌株利用的碳源，HMX的降解率较高；HMX不是细菌生长的最佳碳源，当系统中没有可被细菌利用的其他碳源时，HMX作为唯一碳源时，菌体生长较差，降解效果也较低。分析其原因，碳源在微生物培养基或细胞培养基中有重要的作用，为微生物或细胞的正常生长和分裂提供物质基础。这可能是由于H菌株降解HMX是一种共代谢机制，它是在菌体对较好生长基质的代谢过程中完成对HMX这种较差基质降
解[15] 。采用容易被H菌株利用的碳源，能够保证细菌更好的利用碳源，达到降解HMX的目的。3.1.2 不同氮源对H菌株生长及降解HMX的影响
氮源对H菌株的生长和HMX的生物转化有着重要的影响。实验考察了有机氮源、无机氮源、复合氮源对H菌株生长及转化HMX的影响，不同氮源对H菌株生长及降解的影响如图2所示。由图2可看出，有机氮源包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素对HMX的降解率分别为68.3%、77.4%、86.4%和24.6%，OD值分别为1.892、2.005、2.130和1.027，其效果表现为酵母膏＞牛肉膏＞蛋白胨＞尿素。比较无机氮源(N
H4 )2 SO4 、NH4 NO3 和KNO3 ，其降解率分别为34%、24.8%和31.5%，OD值分别为1.418、1.126和1.319。因此，为了选择最佳氮源，实验进一步考察了复合氮源对H菌株生长及降解HMX 的影响，由图2可看出，以酵母膏为有机氮源时，添加无机氮源(NH4 )2 SO4 时效果最佳，96 h降解率为88.9%；OD为最大2.338；而添加无机氮源NH4 NO3 时，其转化效果为34.5%，OD值为1.452。结果显示，添加复合氮源96 h的降解率在80%以上；添加有机氮源时降解率均达到60%左右；而添加无机氮源时，降解率仅有30%左右。因而有机氮源比无机氮源更有利于H菌株的生长及HMX的生物转化，但有机氮源低于复合氮源对H菌株生长及降解HMX的影响。分析原因可能是，培养基中的氮源，能提供微生物生长所必须的核苷酸、维生素和矿物质元素等（以上物质的合成均需N元素）营养成分的合成原料[16] 。提供的氮源也分为有机氮源和无机氮源，不同微生物根据其自身特点，所需氮源种类也不同。图2 不同氮源对H菌株生长及降解HMX的影响
Fig.2 Effect of different nitrogen source on the growth of strain H and degradation of HMX
注：1—蛋白胨, 2—牛肉膏, 3—酵母膏, 4—尿素, 5—KN
O3 , 6—(NH4 )2 SO4 , 7—NH4 NO3 , 8—(NH4 )2 SO4 +酵母膏, 9—NH4 NO3 +酵母膏NOTE: 1—peptone, 2—beef extract, 3—yeast extract, 4—urea,5—KN
O3 , 6—(NH4 )2 SO4 ， 7—NH4 NO3 , 8—yeast extract and NH4 NO3 , 9—yeast extract and (NH4 )2 SO4 3.1.3 不同金属离子对H菌株生长及降解HMX的影响
不同金属离子对H菌株生长及降解HMX影响如图3所示。由图3可知，不同金属离子对H菌株生长和降解HMX有一定的影响，比较F
e2+ 、Co3+ 、Zn2+ 、K+ 和Ca2+ 对HMX的去除率依次为30%、71%、26.8%、78.1%和88.9%，OD值分别为1.304、1.936、1.093、2.056和2.238，可以发现当加入的金属离子为Ca2+ ，降解率达到最大为88.9%，OD值为2.338。加入不同的金属离子时，发现金属离子对H菌株降解HMX有一定的影响，微量的金属离子是微生物必须的营养因素，且在微生物生命活动中起重要作用。有的金属元素实质上是微生物酶的激活剂，微生物的营养和代谢需要酶的参与才能正常进行[17] 。加入适量的Ca2+ 可以有助于菌的生长，同时高效降解HMX。3.2 H菌株降解HMX的产物分析及途径推测
为了测定H菌株降解HMX的中间产物，在降解反应完成后采用LC‑MS进行检测分析，结果如图4所示。
从图4中可以看出，在未降解时，可检测到物质A，其出峰时间为2.880 min；当被降解48 h后，物质A的峰逐渐减小，同时出现了3个较大的峰，得到了中间产物B（出峰时间3.028 min）、C（出峰时间2.642 min）和D（出峰时间3.737 min）；HMX被降解96 h后，物质A基本上被完全降解，物质B、C和D也逐渐减少。
通过与数据库谱图对比A及其中间代谢产物B、C和D的质谱图，其对应的相对分子质量、保留时间和质核比（m/z）如图5所示。在检测过程中出现的物质有A（HMX）、B（mNs‑HMX（八氢‑1‑亚硝基‑3,5,7‑三硝基‑1,3,5,7‑四氮辛烷））、C（dNs‑HMX（八氢‑1,5‑二硝基‑1,7‑二硝基‑1,3,5,7‑四唑辛烷））和D（次甲基二硝胺（MEDINA））。与Hawar
i[2] 所报道的部分一致，但没有检测到双羟甲基硝胺（HO—CH2 —CNO2 —CH2 —OH）。a. HMX（A）
c. dNs‑HMX（C)
b. mNs‑HMX（B)
d. MEDINA（D）
图5 H菌株降解HMX代谢产物的LC‑MS谱图
Fig.5 LC‑MS spectra of metabolites during HMX degradation by strain H
由测定结果初步推断，H菌株降解HMX的主要途径分为两条，第一条HMX经过还原酶的作用生成HMX亚硝基衍生物为单硝基mNs‑HMX及二亚硝基衍生物的两种异构体dNs‑HMX，后续反应产物尚未测出；第二条是HMX经过水解，开环裂解生成中间产物次甲基二硝胺（MEDINA），如Scheme 1所示。
3.3 H菌株产生的粗酶液比活力分析
绝大多数微生物降解有机污染物都是依赖酶的作用完成的。由图6可知，H菌株降解HMX是在水解酶和还原酶的作用下，水解开环最后生成小分子。因此，分析H菌株产生酶的性质，有助于提高该菌株对HMX的降解效率。
a. initial concentration of HMX
b. pH
图6 不同培养条件下H菌株全细胞蛋白电泳分析
Fig.6 Electrophoresis analysis of whole cell extract of a culture H strainunder various culture condition
不同培养条件对H菌株产生的粗酶液比活力有一定的影响，如表1所示。从表1中可以看出，培养基中不同HMX的初始浓度对菌株产生的粗酶液比活力有重要的影响，在75，100,125 mg·
L-1 HMX作用下，其比活力比对照组分别增加了114.7%，160.3%和108.3%。随着培养液中HMX浓度继续提高，其比活力受到抑制，当培养液中HMX初始浓度达到150 mg·L-1 时，相比对照组，其比活力下降了19.23%,当HMX初始浓度为100 mg·L-1 时，菌株产生的粗酶液比活力达到最佳。分析原因可能当HMX的质量浓度较低时，酶的活性中心未达到饱和，酶的活力会随着HMX质量浓度的增加而增大。随着HMX质量浓度达到100 mg·L-1 时，酶的活性中心趋于饱和，酶的活性达到一个极限[18] ；HMX质量浓度过大时，降低了分子的扩散性，降低酶解反应速率，酶的活力降低[19] 。表2是pH值为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0对H菌株产生的粗酶液比活力影响。从表2中可以看出，当pH值为5.0~7.0时，pH值为6.0和7.0时相对于pH值为5.0时，其比活力分别增加了50.3%，181.8%；当pH值为7.0~9.0时，pH为8.0和9.0时相对于pH值为7.0时，其比活力分别减少了22.1%，35.2%；pH值为7.0时，菌株产生的粗酶液比活力达到最佳。由此可以得出，pH值过高或过低都会影响H菌株产生粗酶液的酶比活力，导致粗酶液的比活力降低或者失活。综上所述，当HMX浓度为100 mg·L-1 ，pH值为7时，H菌株产生的粗酶液比活力最大。表1 不同初始浓度HMX对H菌株产生的粗酶液比活力的影响
Table 1 Effects of different initial concentrations of HMX on the specific activity of the crude enzyme solution produced by strain H
concentration
of HMX/mg·
L-1 total protein
/mg
total enzyme activity
/mmol·mi
n-1 specific activity
/U·m
g-1 0 8.81 1.37 0.156 75 8.06 2.70 0.335 100 7.15 2.90 0.406 125 7.33 2.38 0.325 150 8.13 1.02 0.126 表2 不同pH值对H菌株产生的粗酶液比活力的影响
Table 2 Effects of different pH values on the specific activity of the crude enzyme solution produced by strain H
pH value total protein /mg total enzyme activity
/mmol·mi
n-1 specific activity /U·m g-1 5.0 6.23 0.89 0.143 6.0 6.58 1.41 0.215 7.0 7.12 2.87 0.403 8.0 7.45 2.34 0.314 9.0 7.32 1.91 0.261 在不同培养条件下，H菌株的全细胞蛋白电泳如图6，左侧数据为标准蛋白的分子质量，利用软件ImageJ对各泳道条带进行分析。从图7a中各个泳道分别为HMX初始浓度0，75，100，125，150 mg·
L-1 ，这5个泳道共有14条主蛋白带，其分子质量主要密集在26~120 kD之间，泳道1和5的蛋白条带颜色较浅，说明其蛋白含量较低；泳道2和3的蛋白含量较高，且条带清晰；泳道4颜色较深，但其条带较密，分辨率较差。从图6b中各个泳道分别为初始培养pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，分子质量主要分布在26~120 kD，从图6b可看出，pH为5.0和6.0时，其泳道1和2的颜色较浅，蛋白含量较低；在pH为9.0时，泳道5的条带出现了的拖尾现象，分辨率较差；而泳道3和泳道4的蛋白含量高，且分辨率较好。从上述结果可以看出，不同反应条件下条带数量并无差异，但是条带颜色深浅明显有所不同，所以HMX初始浓度和初始pH值发生变化时，会影响H菌株细胞的生长，从而影响蛋白酶量变化[20] 。4 结 论
（1） 研究了不同营养因素包括碳源、氮源和金属离子对H菌株降解HMX效率的影响。结果表明，最佳碳源、氮源和金属离子分别为苹果酸、复合氮源（酵母膏+（N
H4 )2 SO2 ）和Ca2+ 。（2） 在H菌株降解HMX的过程中，检测到4种中间物质，分别为HMX的亚硝基衍生物单亚硝基mNs‑HMX和二亚硝基衍生物的两种异构体dNs‑HMX及次甲基二硝胺。推测其降解途径可能为两条，第一条是HMX经过还原酶作用降解为mNs‑HMX和dNs‑HMX；第二条是HMX经过水解开环裂解为MEDINA。
（3）H菌株降解HMX过程中，对H菌株产生的粗酶液比活力和全细胞蛋白电泳进行了分析，实验结果表明，在HMX初始浓度为100 mg·
L-1 和pH值为7.0时，酶的比活力最大，蛋白含量最高。（责编：王艳秀）
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摘要
为了进一步研究球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)H菌株对HMX生物转化过程及产酶特性，研究了不同碳源、氮源及金属离子对该菌株生物转化奥克托今(HMX)的效率及其生长的影响；采用液相色谱‑质谱联用仪（LC‑MS）分析了球形红细菌降解HMX的中间代谢产物，推测了可能的降解途径；测定了不同条件对菌株产酶比活力的影响，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析了酶谱。结果表明，该菌株转化HMX的最适碳源、组合氮源和金属离子分别为苹果酸、(N
Abstract
To further study the biotransformation process and producing enzyme properties of bacterial strain of Rhodobacter sphaeroides to HMX, the effects of different carbon sources, nitrogen sources and metal ions on the biotransformation efficiency of HMX of the strain and its growth were studied. The intermediate metabolites of HMX degraded by Rhodobacter sphaeroides were analyzed by liquid chromatography‑mass spectrometry (LC‑MS), and the possible degradation pathways were presumed. The effects of different conditions on the specific activity of the enzymes produced by the strain were determined. The zymograms were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The results show that the optimum carbon source, combined nitrogen source and metal ion for transforming HMX by the strain are malic acid, (N
